因果 WGCNA 分析：揭示基因模块与表型之间的因果效应----CWGCNA包

CWGCNA结合了中介模型和 WGCNA，以发现 WGCNA 模块、模块特征和表型之间的因果关系，从而揭示模块变化是表型产生的原因还是结果。

随着下一代测序技术的深入应用，高通量组学数据的分析方法层出不穷。其中，WGCNA（加权基因共表达网络分析）是最受欢迎的工具之一。正式分析中，WGCNA 首先通过软阈值策略将基因分组为高共表达的模块，这既避免了信息丢失，又增强了结果的稳健性。随后，WGCNA 通过模块与表型性状的相关性，分析与表型相关的特征（比如基因）模块。尽管如此，WGCNA 只能分析模块与表型是否关联，而无法分析这种关联过程中，模块与表型的因果关联（谁是原因？谁是结果？）。

在此基础上，来自美国国家癌症研究所的研究者开发了R包：因果WGCNA (CWGCNA，causal WGCNA)，于今年 4 月份发表在 NAR Genomics and Bioinformatics [IF: 4.60]。它基于传统的 WGCNA 流程，但挖掘了更多信息。CWGCNA 在表型、WGCNA模块和模块特征之间进行「中介分析」，使得WGCNA揭示的无向相关性得以明确化为有向关系，即找到它们的因果关联。更明确的说，CWGCNA 旨在证明究竟是共表达模块变化引起表型发生变化，还是表型变化导致了共表达模块发生变化。

CWGCNA的核心是中介分析，这是一种用于理解机制并识别干预点的方法。它评估一个变量（暴露）对另一个变量（结果）的影响在多大程度上被某个中介变量所介导。具体来说，CWGCNA 利用 WGCNA 模块、模块特征和表型构建中介模型。对于 RNA 表达数据，模块指的是转录谱高度相关的一组基因，特征是该组中的基因。结合limma包的差异分析（回归方法），中介模型利用模块的特征主成分（PC1值，即模块中所有基因的第一主成分）、基因表达水平和表型性状来测试两种因果方向：① “共表达模块→模块特征→表型”（正向），这表示共表达模块通过其特征驱动表型；② “表型→模块特征→模块”（反向），这表示模块只是由于表型的变化而发生变化。通过这些测试，CWGCNA 可以明确表型与模块之间的因果联系及中介机制。

▲ CWGCNA分析的整体流程

不仅如此，CWGCNA 还包含其他用于组学分析的功能，例如基于网络的基因集功能注释、多重 CCA（典型相关分析）多组学数据聚类，以及基于集成方法的多组学分类，这具有更加独特的优势。

本文将仅对该工具的主要部分，即因果 WGCNA 分析进行示例演示。如果铁子们感兴趣的话，可以自行翻阅相关文档。

0. R包下载

用户可以通过以下代码安装或者引用，需要注意的是，CWGNCA 要求 R 语言版本大于等于 4.2.3：

# 从GitHub上安装该包
library(devtools)
install_github("yuabrahamliu/CWGCNA")

1. 数据导入与处理

本教程将使用随 CWGCNA 包一起提供的内置数据。数据包含了来自359个人类胎盘样本的DNA甲基化（DNAm）数据特征矩阵，这些样本基于Illumina 27K和450K平台，收集自10个不同的GEO数据集（当然，你也可以根据自己的研究类型输入其它类型的数据，处理方案有所差异）。

library(CWGCNA)
# 读入特征矩阵，这里是beta（你也可以使用其它类型的数据）
betas <- system.file("extdata", "placentabetas.rds", package = "CWGCNA")
betas <- readRDS(betas)
# 读入性状数据
pds <- system.file("extdata", "placentapds.rds", package = "CWGCNA")
pds <- readRDS(pds)

betas特征矩阵的列表示样本，行表示DNAm探针。矩阵共包含 18626 个探针，它们是各样本间共享的高质量探针。探针值为beta值，即甲基化的程度（如果你是基因表达矩阵，则为基因的表达量），已进行批次效应校正。在 359 个样本中，258 个是正常样本，剩下的101个是由胎盘异常引起的先兆子痫孕期并发症患者样本。

除了betas矩阵以外，同时需要提供的数据框还有 359 个样本的性状数据pds。性状数据包括：

1. 样本ID：sampleid列，对应beta值矩阵的列名；
2. 样本的分组：Group列，对应样本的先兆子痫/对照状态；
3. 样本的妊娠周数：Gestwk列；
4. 婴儿性别：Babygender列；
5. 母亲种族：Ethnicity列；
6. 样本的原始GEO数据集ID：Dataset列，对应样本在 GEO数据库的原始ID。

简单看一下示例数据：

#betas特征矩阵，The DNAm betas matrix
betas[1:6,1:6]
#>             GSM788417  GSM788419  GSM788420  GSM788421  GSM788414  GSM788415
#> cg00000292 0.65961366 0.67591141 0.65709651 0.66077820 0.66847653 0.67436406
#> cg00002426 0.53516824 0.53883284 0.53683120 0.53990206 0.53804637 0.53543344
#> cg00003994 0.17674229 0.16432771 0.16631494 0.16803355 0.16416337 0.16852233
#> cg00007981 0.03553198 0.02934814 0.03189098 0.02765783 0.02768899 0.02764183
#> cg00008493 0.43619912 0.42998023 0.43761396 0.44973257 0.46281094 0.45935308
#> cg00008713 0.07431056 0.06367040 0.06764089 0.06218142 0.05267028 0.05397539

#性状数据，The metadata for the samples
head(pds)
#>    sampleid   Group Gestwk Babygender Ethnicity  Dataset
#> 1 GSM788417 Control      8          M     White GSE31781
#> 2 GSM788419 Control      8          M     White GSE31781
#> 3 GSM788420 Control      8          M     White GSE31781
#> 4 GSM788421 Control      9          M     White GSE31781
#> 5 GSM788414 Control     12          F     Asian GSE31781
#> 6 GSM788415 Control     12          M     White GSE31781

# 样本分组
table(pds$Group)
#> 
#>      Control Preeclampsia 
#>          258          101

# 样本来源的gse编号
table(pds$Dataset)
#> 
#> GSE100197 GSE125605  GSE31781  GSE36829  GSE59274  GSE69502  GSE73375  GSE74738 
#>        65        41        30        48        23        16        36        28 
#>  GSE75196  GSE98224 
#>        24        48

2. 混杂因素的分析

首先使用包中的featuresampling函数，检查betas矩阵中的甲基化 beta 值与pds性状数据中的表型变量之间的关系。这个步骤执行 III 型方差分析（ANOVA），用于测量pds性状数据中各种表型变量（如分组、年龄、性别等）对特征 beta 值数据集所解释的方差。具体的执行命令与参数注释如下：

# 下方命令所需时间小于一分钟
top10k <- featuresampling(betas = betas,  # 特征矩阵
                          topfeatures = 10000,  # 仅选择前10000个最具变异性的DNAm探针构成的数据矩阵
                          variancetype = "sd",  # 定义如何计算方差
                          threads = 6)  # 并行化的线程数量

储存结果的对象top10k是一个列表（展示如下）。其$betas部分包含仅由前10000个最具变异性的DNAm探针构成的数据矩阵，另一个$varicanceres部分则记录了由featuresampling计算的原始 18626 个探针的标准偏差。

top10k$betas[1:6,1:6]
#>            GSM788417 GSM788419 GSM788420 GSM788421 GSM788414 GSM788415
#> cg00000292 0.6596137 0.6759114 0.6570965 0.6607782 0.6684765 0.6743641
#> cg00002426 0.5351682 0.5388328 0.5368312 0.5399021 0.5380464 0.5354334
#> cg00003994 0.1767423 0.1643277 0.1663149 0.1680336 0.1641634 0.1685223
#> cg00008493 0.4361991 0.4299802 0.4376140 0.4497326 0.4628109 0.4593531
#> cg00013618 0.7859429 0.7868591 0.7933922 0.7958716 0.8006630 0.8118193
#> cg00014837 0.8522323 0.8525327 0.8516924 0.8546466 0.8610099 0.8546916

dim(top10k$betas)
#> [1] 10000   359

head(top10k$varicanceres)
#>                   SD
#> cg03729431 0.1848922
#> cg16063666 0.1643842
#> cg05790038 0.1456048
#> cg03316864 0.1454261
#> cg11009736 0.1393115
#> cg20322876 0.1348288

接下来，使用这个函数的$betas进行ANOVA分析：

#This command will take < 1 min
anovares <- featuresampling(betas = top10k$betas,  # 使用 betas
                            pddat = pds,   # 性状数据
                            anova = TRUE,  # 执行 ANOVA
                            plotannovares = TRUE, # 绘制数据的ANOVA结果
                            featuretype = "probe",  
                            plottitlesuffix = "placenta", # 显示在图表标题中的字符
                            titlesize = 18, 
                            textsize = 16, 
                            threads = 6)

结果如上图，featuresampling  返回数据中的每个探针都将通过ANOVA，其结果F统计量、MSS（均方和）和p值将包含在列表anovares的$varianceres部分。

从图表中可以看出，先兆子痫/对照样本组、妊娠周数和婴儿性别解释了最多的方差，这意味着该数据集适合检查先兆子痫/对照样本组之间的 DNAm 差异。然而，妊娠周数和婴儿性别的方差也很高，F值>1。因此，它们是先兆子痫分析的混杂因素，需要调整它们的方差。

3. 因果WGCNA分析

接下来，对数据进行因果 WGCNA 分析。然而，在此之前，使用函数probestogenes将 DNAm 探针的 beta 值统一到基因。参数 group450k850k意味着，对于特定基因，将位于其 TSS200、TSS1500 和第一个外显子区域的探针选出，并取它们的平均值作为该基因的 beta 值 。

# This command will take < 1 min
betasgene <- probestogenes(betadat = betas, group450k850k = c("TSS200", "TSS1500", "1stExon"))

然后，使用另一个函数diffwgcna进行因果WGCNA分析。下面详细介绍一下这个函数的参数：

参数dat接受 beta 值矩阵，pddat 接受 pds 数据框。参数responsevarname和confoundings很重要，因为前者可以指定pds 中的哪一列是目标变量，后者可以指定需要调整的混杂因素。Group传递给前者，而c("Gestwk", "Babygender")传递给后者。它们都对应 pds 中的列名，是进行因果WGCNA分析所必需的。

由于已经将 DNAm 探针名称转换为基因名称，所以将参数featuretype设为“gene”。随后，还将参数topvaricancetype设为“sd”，并将topvaricance设为5000，意味着将在数据中最具变异性的前5000个基因上进行分析（标准偏差最高的那些）。

函数diffwgcna在传统的WGCNA框架内进行因果推断。因此，有必要调用传统的 WGCNA 模块。将向量seq(1, 20, 1)传递给powers参数，这样可以通过网格搜索从1到20选择WGCNA的最佳软阈值。另一个参数rsqcutline设为0.8，目标最小无标度拓扑拟合指数是0.8。

参数mediation很重要，因为它决定在WGCNA流程中是否需要执行因果推断的核心——中介分析。对于每个WGCNA模块，它会构建中介模型以测试两个因果方向。一个方向是“模块→模块基因→先兆子痫”，另一个方向是“先兆子痫→模块基因→模块”。因此，可以确定疾病使得模块变化，或模块驱动疾病。

将参数topn设为1，因此因果推断仅针对最具差异性的1个WGCNA模块及其特征执行。默认情况下，此参数为 NULL，在这种情况下，所有差异模块都会进行因果推断，但分析所有模块会耗费时间。

如果参数plot设置为TRUE，将生成若干图表来展示结果，并且传递给titleprefix参数的字符会显示在图表标题中。参数labelnum表示在 limma 回归和因果推断结果中标记在图表中的前几个特征。可以将其设置为 NULL，使没有特征名称被标记。在这里将其设置为5。参数annotextsize可控制这些特征标签的字体大小。

参数pvalcolname设置为“adj.P.Val”，pvalcutoff设为0.05，表示limma 回归识别的差异模块和基因应该有调整后的p值<0.05。由于这里的数据值是 DNAm beta值，所以将参数isbetaval设为TRUE。参数diffcutoff定义模块特征基因差异的阈值，以选择差异模块，而参数absxcutoff定义模块内基因的 log2FC 阈值，以选择差异基因。由于基因值是beta值，limma 的 log2FC 结果表示组间的 beta 值差异。

这个 WGCNA 分析耗时较长（约25分钟）：

#This command will take ~ 25 min
cwgcnares <- diffwgcna(dat = betasgene, 
                       pddat = pds, 
                       responsevarname = "Group", 
                       confoundings = c("Gestwk", "Babygender"), 
                       featuretype = "gene", 
                       topvaricancetype = "sd", 
                       topvaricance = 5000,
                       powers = seq(1, 20, 1), 
                       rsqcutline = 0.8, 
                       mediation = TRUE, 
                       topn = 1, 
                       plot = TRUE, 
                       titleprefix = "Placenta", 
                       labelnum = 5, 
                       titlesize = 17, 
                       textsize = 16, 
                       annotextsize = 5, 
                       pvalcolname = "adj.P.Val", 
                       pvalcutoff = 0.05, 
                       isbetaval = TRUE, 
                       absxcutoff = 0, 
                       diffcutoff = 0, 
                       threads = 6)

结果cwgcnares是一个包含多个部分的列表，其中名为$limmares的部分是对所有WGCNA模块的 limma 结果，函数生成的柱状图（如下展示）便是基于此结果。它显示数据包含从 ME1 到 ME11 的11个模块，其中7个模块在先兆子痫/对照组之间具有显著差异的特征基因。

此外，diffwgcna还调用 limma 选择每个模块内的差异特征。例如下面这张ME3的火山图显示，与对照组相比，先兆子痫患者组中 516 个基因中的 415 个甲基化降低。$melimmares部分包含每个显著差异模块内的结果。

由于参数mediation设为TRUE，且参数topn设为1，最具差异性的模块ME3的因果推断结果已返回，$mediationres 部分记录了这个结果。相应地，ME3 获得了额外的火山图来显示其中介结果（如下图展示）。在这第二个火山图中，319 个蓝点所指的基因在“ME3→ME3基因→先兆子痫”因果方向（反向）起中介作用，而只有 2 个红点所指的基因在“先兆子痫→ME3基因→ME3”方向（正向）起中介作用。y轴和x轴分别显示筛选差异基因时的-log10（调整后的p值）和先兆子痫/对照beta值差异。

这 319 个基因与先兆子痫中的炎症应激有关，例如 ME3 中发现的 top 基因 IL3 和 IL17F，它们都是炎症相关的细胞因子。由于多数基因的因果方向是从ME3到先兆子痫，因此可以得出结论，炎症是这种疾病的原因而非结果。

同时，CACNA1S 是从 ME3 到先兆子痫的因果方向中的 top 基因。该基因在胎盘中表达，编码负责血管收缩的钙通道。鉴于先兆子痫是一种妊娠期高血压疾病，CACNA1S 对其的驱动作用非常明显。此外，该基因是治疗先兆子痫的小分子药物苯磺酸氨氯地平的靶标，这进一步证明了这里的因果推断是合理的。

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