IF=37.3！烟台毓璜顶医院宋西成团队利用单细胞数据分析助力m6A生信分析一举拿顶刊！

又到了糖糖给小伙伴们送福利的时间啦！

今天糖糖给大家带来的是一篇发表在Molecular Cancer上的37分国自然热点文章，研究通过单细胞数据分析构建了原发性和转移性肺腺癌（LUAD）的全球单细胞景观，生信分析与实验结合，揭示了LUAD血管生成和转移中基于IGF2BP2的机制。

在这篇文章中，不仅有功能富集分析、KEGG通路分析等经典分析技术，也有细胞转染、蛋白质印迹等实验方法和伪时间轨迹分析、基因调控网络分析

等单细胞分析手段。可谓是，集宝贵思路于一体，小伙伴们错过可就太亏了！

下面就跟着糖糖一起来看看这篇文章吧！

 (ps：不知道怎么创新的uu来找糖糖！这里不止新鲜出炉的生信热点方向，还有一茬接一茬的新颖思路等着你噢！）

题目：m6A 甲基化阅读蛋白 IGF2BP2 可激活内皮细胞，促进肺腺癌的血管生成和转移

杂志：Mol Cancer

影响因子：IF=37.3

发表时间：2023年6月

后台回复“666”获取原文，文献编号231102

研究背景

根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的最新全球癌症负担数据估计，肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，到2022年，肺癌仍将是中国最常见的癌症。在长期的临床实践中发现，许多 LUAD 患者在初诊时已有远处转移，而 LUAD 的远处转移是最大的临床挑战，其分子分期和细胞谱可能与早期癌症不同。目前，LUAD 的抗血管生成靶向治疗被认为是治疗转移性 LUAD 的有效策略。因此，需要全面深入地探索转移性 LUAD 生态位中与血管生成相关的细胞动力学和分子特征，以有效靶向关键驱动基因，制定个性化的治疗策略。

胰岛素样生长因子 2（IGF2）mRNA 结合蛋白 2（IGF2BP2）是一种 RNA 结合蛋白（RBP），对 mRNA 的定位、稳定性和翻译控制具有重要的转录后调控作用 。已有研究表明，IGF2BP2 的高表达与 LUAD 的不良预后有关，抑制 IGF2BP2 的表达可减轻 LUAD 的生长和血管生成 。

数据来源

研究思路

从GSE131907数据集中获取了11个远端正常肺组织、11个原发性LUAD组织和4个转移性LUAD组织的单细胞转录组学图谱。构建来自原发性和转移性 LUAD 的 93,610 个细胞的全球单细胞图谱，然后分析LUAD细胞类型来探索转移性LUAD细胞的克隆进化轨迹。接着对LUAD进行伪时间轨迹分析，通过功能富集分析探索所提出的时间相关DEGs所涉及的信号通路和生物学功能。之后在单细胞图谱中鉴定内皮细胞亚群，随后，进一步鉴定了LUAD_IGF2BP2亚群和En_IGF2BP2亚群共有的标记基因。最终，以单细胞分辨率表征肺多细胞生态系统，探讨LUAD血管生成和转移的潜在机制。本研究的分析流程如图 1B 所示。

主要结果

1.原发性和转移性 LUAD 的全球单细胞图谱

在本研究中，CD34表达被用来描述肿瘤血管生成的病理状态。免疫荧光结果显示，转移性 LUAD 的 CD34 表达高于原发性 LUAD（图 1A）。从 GSE131907 数据集中获得了 11 个远端正常肺组织、11 个原发性 LUAD 组织和 4 个转移性 LUAD 组织的 scRNA-seq 数据，以进一步探索原发性和转移性 LUAD 的生态图谱。经过数据预处理和质量控制（图 2A-C），共捕获了 93,610 个高质量单细胞，并将其聚类为 19 种细胞类型，包括 LUAD 细胞（LUAD）、内皮细胞（En）、巨噬细胞（Mac）和其他细胞（图 1C）。细胞集群中阳性表达的标记与最近的 scRNA-seq 和实验室研究等发表的基因特征一致，并与相应细胞的表型特征一致（图 1D）。LUAD 肿瘤细胞中出现了多个或低拷贝数事件（即恶性拷贝数变异事件）（图 1E）。进一步分析发现，转移性 LUAD 代表了一个多细胞生态系统，与对照肺和原发性 LUAD 的多细胞生态系统截然不同（图 1F）。值得注意的是，在转移性 LUAD 中观察到 LUAD 细胞丰度急剧增加。总之，通过单细胞分析初步构建了原发性和转移性 LUAD 的全球单细胞景观，并探索了不同样本类型中细胞生态的改变。

图1 构建原发性和转移性 LUAD 的全球单细胞图谱

图2 scRNA-seq的数据预处理和质量控制

2. 转移性 LUAD 肿瘤细胞的克隆进化轨迹

肿瘤细胞的克隆进化过程往往是癌症发展的关键。因此，为了探索转移性 LUAD 细胞的克隆进化轨迹，分析 LUAD 细胞类型。值得注意的是，与原发肿瘤相比，LUAD细胞在转移性LUAD中含量很高，因此对LUAD细胞进行亚群分析，并构建了单细胞图谱（图3A）。在探索原发性和转移性 LUAD 中 LUAD 细胞亚群的细胞生态学时，发现转移性 LUAD 中 LUAD_FAM83A 和 LUAD_IGF2BP2 亚群的丰度明显高于原发性肿瘤（图 3B）。随后在单细胞图谱中证实了FAM83A和IGF2BP2的表达（图3C），荧光结果证明CD34高表达的LUAD肿瘤中IGF2BP2的表达明显高于CD34低表达的肿瘤（图3D），揭示了IGF2BP2与血管生成之间的密切关系。为了进一步探索转移的潜在分子机制，研究人员鉴定了原发性和转移性LUAD细胞亚群中的DEGs（图3E）。根据对LUAD细胞的伪时间轨迹分析（图3F），发现了从原发性LUAD到转移性LUAD的进化趋势，这表明了LUAD细胞亚群从原发性LUAD到自然选择和转移性疾病的潜在结构变化（图3G）。通过功能富集分析探讨了所提出的与时间相关的 DEGs 所涉及的信号通路和生物学功能，发现 LUAD_IGF2BP2 亚群在囊泡合成和信号分泌方面显著富集（图 3H）。综上所述，研究推断了转移性LUAD细胞亚群的起源和克隆进化轨迹，并鉴定了参与进化过程的基因及其生物学功能。

图3 转移性 LUAD 细胞的克隆进化轨迹

3. 转移性 LUAD 的内皮细胞特征

癌症进展的特点是内皮细胞被激活，进而促进肿瘤血管生成。因此，在单细胞图谱中确定了内皮细胞亚群（图 4A），并在原发性和转移性 LUAD 中观察到每个内皮细胞亚群独特的细胞生态。值得注意的是，在原发性 LUAD 转移过程中，En_S100A9、En_KRT19 和 En_IGF2BP2 亚群明显增加（图 4B）。在 LUAD_IGF2BP2 亚群和 En_IGF2BP2 亚群中 IGF2BP2 同时表达（图 4C，D），表明这两个亚群之间存在相互作用。随后，进一步确定了 LUAD_IGF2BP2 和 En_IGF2BP2 亚群共有的标记基因，包括 IGF2BP2、IGF2BP3、SOX4、ID1、WASF2、ADGRG6 和 FKBP1A（图 4E）。富集分析（图 4F、G）显示，这些特定的细胞亚群表现出重要生物功能的显著激活，如内吞。进一步的 GSEA 分析显示，血管生成、外泌体、上皮间质转化（EMT）和 N6-甲基腺苷（m6A）在特定细胞亚群中明显富集（图 4H）。基于这些发现，初步构建了转移性 LUAD 的内皮细胞图谱。 

图4 转移性 LUAD 中的内皮细胞景观

4. 靶向 IGF2BP2 可减轻 LUAD 细胞的迁移、侵袭和血管生成

接下来，研究IGF2BP2对LUAD细胞生物学行为的影响。在瞬时转染中，设计了三种靶向 IGF2BP2 的特异性 siRNA，其中 si-IGF2BP2#1 对 A549 和 NCI-H1299 细胞的干扰效果最佳（图 5A-C）。根据伤口愈合实验，si-IGF2BP2 能显著降低 A549 和 NCI-H1299 细胞的迁移（图 5D-F）。此外，的透孔试验结果表明，si-IGF2BP2 能明显抑制 A549 和 NCI-H1299 细胞的侵袭（图 5G, H）。用si-IGF2BP2转染的A549细胞的条件培养液培养HUVEC后，分支点和毛细血管长度都明显减少（图5I-K），表明LUAD细胞中IGF2BP2的敲除抑制了血管生成。

图5 靶向 IGF2BP2 可减轻 LUAD 细胞的迁移、侵袭和血管生成

5.LUAD细胞衍生的外泌体介导IGF2BP2转移到微环境内皮细胞，激活PI3K-Akt信号促进血管生成

上述研究表明，转移性LUAD可能通过外泌体实现血管生成。因此，为了研究LUAD细胞衍生的外泌体转移到肿瘤微环境中内皮细胞的机制，构建了血管生成特异生态型的全局调控图谱，并得到了从LUAD_IGF2BP2到En_IGF2BP2亚群的整合调控网络（图6A）。随后发现，外泌体标记基因（CD9、CD63、TSG01 和 CD81）在所有 LUAD 亚群中均高表达，证明了 LUAD 细胞中外泌体的形成（图 6B）。结合 IGF2BP2 在 LUAD_IGF2BP2 和 En_IGF2BP2 亚群中的表达情况，可以推断 LUAD 细胞衍生的外泌体 IGF2BP2 被内皮细胞内化。此外，还发现在 En_IGF2BP2 亚群中，赋予 LUAD 血管生成和转移的 PI3K-Akt 信号通路被激活（图 6C）。这些结果表明，LUAD细胞可能将外泌体IGF2BP2传递给内皮细胞，从而激活PI3K-Akt信号通路，最终促进血管生成。

图6 在内皮细胞中过表达 IGF2BP2 可激活 PI3K-Akt 信号，促进血管生成

6.IGF2BP2 介导 FLT4 的 m6A 修饰并激活 PI3K-Akt 信号通路

研究人员进一步探讨了 IGF2BP2 如何激活 PI3K-Akt 信号，从而促进血管生成。研究发现，FLT4 可能是 IGF2BP2 激活 PI3K-Akt 信号的靶基因。免疫荧光实验显示，CD34高表达的LUAD样本病灶内皮细胞中FLT4的RNA水平（图7A）和蛋白水平（图7B）明显高于CD34低表达的样本。通过分子对接预测了 IGF2BP2 蛋白与 FLT4 的 mRNA 的结合潜力，对接能量为 -750 kj/mol，表明二者之间有很大的靶向结合潜力（图 7C）。多重免疫荧光也证明了 FLT4 RNA 与 IGF2BP2 蛋白的共表达（图 7D）。敲除 IGF2BP2 能显著降低 A549 和 NCI-H1299 细胞中 FLT4 的 m6A 水平（图 7E，F）。此外，在敲除 IGF2BP2 的 A549 和 NCI-H1299 细胞中，FLT4 蛋白水平也明显下调（图7G-J）。这表明IGF2BP2可通过介导FLT4的m6A修饰上调FLT4的表达。此外，在敲除IGF2BP2的A549和NCI-H1299细胞中，PI3K和AKT蛋白水平明显下降（图7K，L），表明IGF2BP2参与激活了PI3K-Akt信号通路。这些结果表明，在转移性LUAD的克隆演化过程中，IGF2BP2表达的LUAD细胞亚群将IGF2BP2扩散到肿瘤微环境中，并通过细胞内化被内皮细胞吸收，随后通过m6A修饰靶向增强FLT4的RNA稳定性，从而激活PI3K-Akt信号通路，促进血管生成（图7M）。

图7 IGF2BP2 通过介导 FLT4 的 m6A 修饰激活 PI3K-Akt 信号通路

7.构建基于 IGF2BP2 的 LUAD 预后评分系统

进一步构建了 IGF2BP2-FLT4-PI3K-Akt 信号转导-血管生成的全球调控网络（图 8A）。然后评估了这些网络基因在预测 LUAD 预后方面的潜力。在TCGA-LUAD数据集中探讨了关键网络基因与临床指标的关联，发现它们与临床参数，尤其是OS和无复发生存期（RFS）显著相关（图8B）。根据关键网络基因（包括IGF2BP2、FLT1、FLT4、PIK3R3、PIK3CB和PIK3CD）建立了一个多变量cox回归模型，称为基于IGF2BP2的预后评分系统，并根据中位值将患者分为低分组和高分组。生存分析表明，低分组的 OS 和 RFS 结果明显优于高分组（图 8C、D）。与时间无关的 ROC 曲线显示该模型在预测 OS 和 RFS 方面表现出色（图 8E）。基于 IGF2BP2 的预后评分系统在外部验证数据集（GSE72094）中得到了证实（图 8F、G）。结合单变量和多变量回归分析发现，基于 IGF2BP2 的模型和分期是影响 LUAD 预后的独立危险因素（图 8H，I）。建立了一个包含这两个独立风险因素的提名图（图 8J）。校正曲线显示，提名图可以准确预测一年、三年和五年的 OS 结果（图 8K-M）。这些结果表明，IGF2BP2-FLT4-PI3K-Akt 信号转导-血管生成网络在 LUAD 预后中起着至关重要的作用，这为对 LUAD 患者进行准确的风险分层提供了理论依据。

图8 开发基于 IGF2BP2 的 LUAD 预后评分系统

8.筛选潜在的 IGF2BP2 小分子抑制剂

基于 GDSC 和 CTRP 数据库，我们根据相关系数 < -0.1 和调整后 p < 0.05 的阈值预测了潜在的 IGF2BP2 小分子抑制剂。因此，我们筛选出了 GDSC 和 CTRP 数据库共享的三种小分子抑制剂，包括曲美替尼、赛鲁米替尼和达沙替尼（图 9）。

图9 基于 GDSC 和 CTRP 数据库预测 IGF2BP2 的潜在小分子抑制剂

文章小结

这项研究通过单细胞转录组学分析构建原发性和转移性LUAD的全球单细胞景观，揭示LUAD血管生成和转移中基于IGF2BP2的机制，为阐明LUAD转移的相关细胞动力学和分子特征提供了机会。这篇文章提供了宝贵的单细胞分析思路，再加上干湿结合的实验验证成功获得37分的高分。文章中的一系列分析手段不难理解，重点是学习文章中对不同分析手段的充分运用和清晰思路。相信小伙伴们在看完这篇文章后，也能学到创新思路发表高分文章！感兴趣的小伙伴还不快快跟着糖糖学起来！

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