生存预后模型，经久不衰的“新套路”！

哈喽，大家好啊 ，又好久不见了！小编回归的7月，就先给大家分享一篇简单的生信预后类文章吧！虽说这是一篇比较中规中矩的经典生信套路文章，影响因子也不是很高，但我们还是可以从中学到一些作者思路设计的小技巧！不妨往下接着看~

数据来源

1. TCGA数据库：554名前列腺癌患者的FPKM数据（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments，每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments），临床生存数据和肿瘤基因突变相关数据。

2. GEO数据库：GSE70770、GSE46602、GSE2443、GSE5377、GSE5803、GSE29650、GSE32269、GSE74685、GSE6811、GSE46002和GSE60329

3. The Fudan Data Portal for Cancer Genomics数据库：MSKCC数据集

4. Garg AD et al.文献：获取33个人类ICD相关基因

5. HPA数据库：免疫组化染色结果

背景介绍

免疫原性细胞死亡（ICD）在肿瘤进展和免疫反应中起着至关重要的作用。然而，ICD相关基因和亚型在前列腺癌（PCa）肿瘤微环境（TME）中的作用仍然未知。

为了评估前列腺癌与ICD反应之间的关联，作者根据ICD相关基因确定了前列腺癌人群中具有不同ICD水平的亚组。利用ICD组间差异表达基因（DEGs）建立预后风险模型，分析不同ICD水平患者预后和免疫微环境的差异。结果表明，这种新的ICD相关风险模型可用于预测前列腺癌的预后并评估免疫环境。

结果解读

1. ICD和PCa

作者在Garg AD等人发表的文献中选定了33个人类ICD相关基因，所有这些基因都可以作为ICD相关的危险信号或调节分子。在TCGA-PRAD样本中，19个ICD基因表现出不同程度的突变，大多数为错义突变，总体突变频率为5.57%，其中，PIK3CA的突变频率最高（图1A）。同时，作者观察到ICD基因存在不同程度的CNV变异（图1B），HMGB1， HSP90， IL17RA， CD8A， CALR， IL1B， IL17A， IFNB1等表现出广泛的CNV缺失，有32个基因在染色体上表现出CNV变异（图1C)。此外，23个ICD基因在良性肿瘤（n = 52）和前列腺癌（n = 501）之间表现出显著的差异表达（图1D)。这些结果可能表明ICD与前列腺癌之间存在潜在关联。

图1 PCa中的ICD相关基因突变和CNV分析

2. PCa 中的 ICD 亚型

作者将GSE70770队列、MSKCC队列和TCGA-PRAD的数据整理合并，命名为“共同矩阵，这个共同矩阵包含来自901例患者的近18,000个基因表达数据。作者从中提取先前确定的33个人类ICD相关基因的表达数据，生成PCa患者的ICD基因表达谱。一致性聚类将901名患者分为两个亚组：ICD相关基因高表达组（ICD-H）和ICD相关基因低表达组（ICD-L）（图 2A)。Kaplan-Meier 分析结果表明，ICD-H 组和 ICD-L 组之间的 PFS 存在显著差异 （p = 0.002） （图2B)。ICD-H的TME表现出更丰富的T细胞、B细胞和树突状细胞浸润（图2C)。为了从ICD表达水平的角度解释患者分层现象，作者分析了临床信息和ICD基因在不同人群中的分布（图2D)，确定了ICD-H和ICD-L亚型之间的差异，如ICD-H中IL6，IL1B，IL10和其他白细胞介素的表达更高。相比之下，HMGB1在ICD-L中更活跃。GSVA分析揭示了ICD-H的主要功能通路包括T细胞受体信号通路、MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路，间接表明ICD-H具有活跃的免疫功能。同时，ICD-L主要参与DNA合成、碱基切除修复和不饱和脂肪酸合成（图 2E)。

为了进一步分析，作者结合901例患者的全基因组数据，在ICD-H和ICD-L之间筛选了120个ICD- DEGs（图2F)。这些DEGs的功能主要集中在TNF信号通路、NF-kappa B信号通路、IL17信号通路等相关通路（图2G）。

图2 通过一致性聚类获得的不同聚类亚型之间的临床特征、生存期和肿瘤免疫微环境之间的比较

3. PCa 中的基因亚型

对 120个 DEGs 数据集进行单变量 Cox 回归分析，共产生 70 个预后相关基因 （PRGs）。基于PRGs，对901例患者进行聚类分析，将人群分为三组（A，B和C）（图 3A)。K-M生存分析显示，三组患者的生存差异显著(p< 0.001)，其中C组患者的生存预后最好(图3B)。在热图中还观察到三组之间的基因表达差异，以及C组和ICD-H组之间的高度重叠（图3C），表明免疫细胞浸润更丰富（图3D)。在这项研究中，将共同矩阵中具有完整生存信息（生存时间、生存状态和PRGs表达）的患者队列按照7：3的比例，随机将其分配到训练集（n = 579）和测试集（n = 248）。通过在训练集中使用LASSO回归方法，并设置10倍交叉验证，获得了最优模型（图 3E、F、G)。

图3 根据PRGs进行共识聚类和LASSO分析

4. 风险签名

筛选四个风险基因（TIPARP，SERPINA3，MT1M和CST2）后，每个样本根据以下公式获得风险评分：risk_score = exp（CST2） * 0.1095 − exp（TIPARP） * 0.2893 − exp（SERPINA3） * 0.2235 − exp（MT1M） * 0.1915。将训练集中的中位风险评分（-3.9943）设置为临界风险评分，以区分患者的风险水平。随后，训练组和测试组的生存分析表明，由该特征确定的风险分层可以帮助预测PFS（图 4A、B)。ROC曲线用于评估风险评分的敏感性和特异性。训练组的1年、3年和5年AUC值分别为0.749、0.688和0.652（图4C），测试组的AUC值分别为0.742、0.731和0.704（图4D)。值得注意的是，外部测试集（GSE46602）与训练组的结果一致，高危患者的PFS较短（图 4E)。

将整个数据（训练组和测试组）的临床数据和风险评分结合起来，构建一个可以预测疾病进展的列线图（图4F)。ROC曲线显示列线图对PFS具有良好的预测能力，表现出较高的准确度，1年、3年和5年生存期的AUC值分别为0.760、0.780和0.704（图4G)。列线图对1年、3年和5年的预测能力与理想模型的预测能力高度吻合(图4H)，模型的一致性指数C-index为0.73，表明模型的准确性较好。对于风险基因，TIPARP、SERPINA3和MT1M在低风险组中的表达更活跃（图4I-J），而CST2是高危组中唯一的高表达基因。结合ICD基因分析发现，CST2作为高危因子，与IL6呈显著负相关，而TIPARP、SERPINA3和MT1M与IFNGR1、HSP90AA1和HMGB1呈显著正相关（图4K)。ICD水平与树突状细胞（DC）活性呈强相关，结合免疫细胞分析发现CST2与静息DC活性呈显著正相关，而SERTAD3与活化DC活性呈显著正相关。TIPARP和MT1M也与巨噬细胞和CD4 + T细胞活性有关（图 4L)。

图4 风险模型在训练组、测试组和外部测试集中的预后值

5. 不同分层之间的关联

ICD-L组的风险评分低于ICD-H组（p<0.001）（图 5A)。A组、B组和C组之间的风险评分也存在显著差异，C组的风险评分最低（p<0.001）（图5B)。“低风险组 C-ICD-H”人群表现出高度重叠（图5C)。关于高风险和低风险评分在免疫微环境的差异，低风险组的免疫细胞浸润评分较高（图5D）， 而TMB较低 （图 5E）。“ICD-H”（图5F）和“C组”（图5G）人群的TMB水平也较低，这与更好的生存预后相对应（图5H)。

风险评分和TMB联合分析发现，“高危组-高TMB组”患者预后最差，其他3种组合间PFS差异无统计学意义（图5I)。低危组(图5J)和ICD-H组(图5K) 的PD-L1 (CD274)、IDO1和LAG3表达较高，而C组PD-1、PD-L1、CTLA4、IDO1和LAG3表达较高(图5L)。然而，高危人群的CNV水平较高(图5M, N)，干细胞分化较差(图5O)。

图5 不同分层之间的关联和区别

综上所述，可能有一组C组为代表的预后良好、ICD水平高的前列腺癌患者，这些患者可以通过本研究提出的风险预后模型来识别。该组可能从免疫治疗中受益，因为它们显示出更高的免疫检查点基因表达，更低的TMB和更丰富的免疫细胞浸润。识别这些患者可能有助于定制个性化的治疗方法，最终改善前列腺癌患者的预后。

6. 构建ANN模型

考虑到前面的患者的完整生存数据有限，作者试图创建一个更大的数据集进行分析，从而进一步提高对前列腺癌进展的预测能力。于是从GEO平台获得了9个数据集。这些数据集被随机分配以创建五个训练集（GSE2443,GSE5377,GSE5803，GSE29650和GSE32269）共154个样本，去除正常前列腺和不完整数据样本后减少到144个样本，包括60个HSPC样本和84个CRPC样本。四个测试集 （GSE74685,GSE6811,GSE46002和GSE60329）共370个PCa样本，包括118个HSPC样本和196个CRPC样本，其余56个样本没有明确信息记录或属于正常前列腺组织。

按照预设的筛选条件（p< 0.05，log2 FC< 1.5），根据训练组鉴定出8个差异表达基因（MYLK、SPP1、ACTG4、PCaP3、MSMB、KLK1、HBB和AZGP7） (图 6A、B)。SPP1和HBB是CRPC中上调的基因，而其他基因是下调基因。采用随机林树分析筛选DEGs基因，可以有效区分PCa类型（HSPC/CRPC）。决策树的最佳数量为 68 （图 6C-D)。所有八个DEGs都包含在RFG中，用于后续的模型构建。利用神经网络算法对各RFG的权重值进行优化，得到最终的ANN模型（图6F)。训练集HSPC组的60个样本中有53个被准确预测，而CRPC组的84个样本中有81个被准确预测。ANN模型的AUC为0.983（图6F).

在测试集中测试ANN模型的准确性，发现118个HSPC样本中有83个被准确预测，CRPC组196个样本中有123个被准确预测，AUC为0.718（图6G)。这些结果证实，八个选定的基因可有效预测前列腺癌的进展。最后，分析RFGs与风险评分(RS)的潜在关联，发现两个CRPC上调基因SPP1和HBB与风险基因CST2显著正相关。TIPARP、SERPINA3、MT1M这三个“保护”因子与CRPC下调基因显著正相关(图6H)。这表明四种预后模型基因与前列腺癌患者的临床进展密切相关。

图6 构建ANN模型预测前列腺癌进展

7. 实验验证

我们使用qRT-PCR测量正常前列腺组织细胞RWPE-3和不同肿瘤细胞状态（如LNCaP和C1-2细胞系）中四个风险基因（TIPARP，SERPINA1，MT4M和CST2）的相对mRNA表达水平。结果显示，随着细胞状态从正常变为肿瘤，CST2的mRNA表达水平增加。与RWPE-1相比，LNCaP和C4-2细胞中的MT1M和TIPARP水平明显较低。SERPINA3水平在LNCaP细胞系中显著升高，但在C4-2和RWPE-1细胞系中较低（图 7A-D)。此外，检索免疫组织化学（IHC）染色结果后，HPA数据库中正常组织和肿瘤组织中CST2和SERPINA3的图片相似。与正常组织中相比，PCa组织中CST2的相对蛋白表达水平显著高于正常组织（图 7E），并且在相应的组织中，SERPINA3也有类似的结果（图7F)。蛋白质印迹（WB）结果还显示，CST2（图7G） 和 SERPINA3 （图7H）在C4-2细胞系中显著高于前列腺细胞RWPE-1。

图7 实验验证风险基因的预测能力

到此，整篇文章的分析就结束了，乍一看，这不就是很常规的预后风险模型的文章套路吗？但是，我们仔细研究不难发现，这篇文章还是有作者的小心思的！首先，作者不是上来直接筛选正常组织和肿瘤组织的差异表达基因，而是选择了一个切入点“免疫原性细胞死亡（ICD）”，瞬间将文章的档次拉高；其次，作者步步为营，通过ICD基因将患者分为ICD-H组和ICD-L组，然后在这2组中继续进行差异基因分析，获得了120个DEGs，进一步对DEGs进行分析，获得了70 个预后相关基因 （PRGs），根据PRGs将患者重新分成预后存在显著差异的A、B、C三组，构建风险模型，同时又将这预后不同的三组与ICD表达水平不同的两组进行交叉比较，反复横纵对比，往往更能发现问题！作者认为可能有一组C组为代表的预后良好、ICD水平高的前列腺癌患者，这些患者可以通过本研究提出的风险预后模型来识别。你以为到此就结束了？不！作者继续创建一个更大的数据集进行分析，构建ANN模型，验证模型预测前列腺癌进展的能力。除此之外，作者还进行了基础实验验证，可以说是一篇非常完美的“干湿结合”文章。

最后，再通过一张流程图，回顾下文章的整体思路吧，希望能对比有所启发！

文章思路流程图

参考文献：

Kang Z, Sun JB, Lin F, Huang XY, Huang Q, Chen DN, Zheng QS, Xue XY, Xu N, Wei Y. Subtype and prognostic analysis of immunogenic cell death-related gene signature in prostate cancer. Front Oncol. 2023 Jun 6;13:1160972. doi: 10.3389/fonc.2023.1160972. PMID: 37346077; PMCID: PMC10279955.

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