Nature喊你看过来——空间转录组与单细胞转录组联合分析

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作者沐秋：益站单细胞专栏作者。关注沐秋小姐姐与益站，带你了解单细胞分析的那些事儿。

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单细胞 RNA 测序（scRNA—seq）能够系统地识别组织中的细胞群，但对其空间组织的描述仍然具有挑战性。基于微阵列的空间转录组学（spatial transcriptomics，ST）方法与同一样本生成的 scRNA—seq 数据相结合，该方法使用一组 spots 揭示基因表达的空间模式，每个 spots 捕获多个相邻细胞的转录组。为了准确描述不同组织区域的细胞组成，研究者们引入了一种多模态交叉分析方法（multimodal intersection analysis，MIA）。该方案 2020 年发表于 Nature Biotechnology 杂志上：

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Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas。

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将多模态交叉分析应用于原发性胰腺肿瘤，发现导管细胞、巨噬细胞、树突状细胞和癌细胞亚群存在空间限制性富集分布，并与其他细胞类型存在明显的共富集。基于 scRNA—seq 定义的亚群结构的方法可以用于揭示复杂组织固有的相互作用。

下面就让我们一起了解下单细胞和空间常规以及联合分析内容吧!

1. 单细胞转录组数据鉴定肿瘤细胞

两个未治疗的患者新鲜的原发性 PDAC 肿瘤：PDAC-A 和 PDAC-B 行进行 scRNA—seq 和 ST 分析。scRNAseq 数据中每个细胞含有大约 2500—3300 个 UMI 和大约 1400—1700 个基因。使用一个递归层次聚类方案（recursive hierarchical clustering scheme）推断细胞类型，方案中用到了 k 近邻（k—nearestneighbors， KNN）平滑算法（smoothing algorithm）来减少 scRNAseq 数据中的噪声。

在 PDAC-A 和 PDAC-B 肿瘤样本中分别鉴定了 15 个和 11 个不同的细胞类型。并基于 scRNAseq 的拷贝数变异（CNV）分析区分 PDAC 癌细胞与非恶性导管细胞。采用双重免疫荧光验证癌细胞群。

2. PDAC 组织的空间转录组分析

为了生成组织切片的无偏倚转录组图谱，将来自同一肿瘤样本的两个没经过固定的 PDAC 组织的低温切片装在到到空间条形码 ST 微阵列载玻片上。在苏木精和伊红（H＆E）染色和明场成像后，对切片进行清晰的组织学特征注释。在 PDAC-A 肿瘤切片中，人为定义了四个主要区域：癌细胞和间质增生区域、非恶性导管上皮、基质和正常的富含腺泡的胰腺组织。PDAC-B 组织切片未见正常胰腺组织，但存在癌旁存在间质间隙。

对样品进行 ST 分析，首先通过主成分分析（PCA）对所有 ST 位点上表达差异最大的基因进行区域分类。基于主成分得分对每个 ST 阵列的点进行聚类后，结合 marker 基因表达分析发现，空间 spots 簇与单独的组织学注释结果一致，说明仅根据 ST 基因表达是能够识别切片内不同的空间区域的。

3. 多模态交叉分析（MIA）

采用 MIA 联合 scRNAseq 和 ST 数据进行分析。软件首先描述细胞类型特异性基因集和组织区域特异性基因集，然后确定基因集的重叠比随机情况下预期值高（富集）还是低（损耗）。在 scRNAseq 的数据中，识别每个细胞类型中比其余的细胞都高表达的基因，定义细胞类型基因集。基于 ST 数据，确定各个空间区域相对于其他区域有显著高表达的基因集。基于 scRNAseq 和 ST 的基因集， MIA 计算每一对细胞类型基因集的特异性和区域特异性，并采用超几何检测来评估显著的富集或耗竭。例如：通过 PDAC-A 样本中的成纤维细胞特异性基因与 ST 数据中针对癌症区域的一组基因有明显重叠(图 2g)。

4. 跨组织区域的导管细胞亚群识别与定位

应用 MIA 检测整个组织的亚群细胞空间分布，来表征细胞群内的异质性。鉴定了末端导管细胞亚群，中心腺管亚群，抗原呈递导管细胞等。鉴定不同细胞亚群 marker 基因，并结合双重免疫荧光验证导管细胞群。

针对每个导管亚群的标记基因，通过 MIA 确定这些导管亚群在组织区域内的富集。结果显示，PDAC-A 样本中所有导管亚群都富集于组织的导管区域。只有缺氧和终末导管细胞群在癌症区域显著富集。这些导管细胞表现出的转录表型可能反应了周围组织发出的环境信号: 肿瘤区域的导管细胞可能由于低氧含量而表达低氧反应基因。

5. 不同癌症细胞亚群比对分析

为了了解是否存在不同细胞类型的共域化分布作者进行了亚群比对分析。对于每个组织切片的富集区，采用层次聚类进一步将癌富集区域划分为转录相关亚区(图 5a-c)。在定义了特定于每个子集区域/亚区域的基因集后，再次使用 MIA 比对的方法研究与子区域相关基因集与 scRNAseq 数据亚群基因集间的重叠(图 5d) 。研究发现 PDAC-A-1 样本的 Cancer Cluster2 中只有癌簇 1 亚群和癌簇 2 亚群富集。

文章内容还没结束，但今天的分享就到这里，最近在查资料，因此简单介绍了单细胞结合空间转录组的早期方案：MIA。

就目前来看联合分析方案已百花齐放， MIA 值得你来了解。

参考文献

Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas[J]. Nature Biotechnology, 2020: 1-10.

OK，今天的分享到此为止，希望能对您有所帮助。

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